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本公司提供的耐热DNA聚合酶彻底去除宿主基因组DNA和表达载体DNA,避免由于酶本身的DNA残留而导致的假阳性;优化Buffer体系,提高了PCR的灵敏度和特异性。
下表为三种耐热DNA聚合酶的基本特性:
基本特性 |
5'→3'外切酶活性 |
3'→5'外切酶活性 |
末端加A |
延伸速度 |
有效扩增长度 |
Taq DNA polymerase |
有 |
无 |
有 |
1-2 kb/min |
简单模5 kb,复杂模板3 kb |
pfu DNA polymerase |
无 |
有 |
无 |
0.5 kb/min |
简单模3 kb,复杂模板1 kb |
Taq plus DNA polymerase |
有 |
有 |
有 |
1 kb/min |
简单模15 kb,复杂模板10 kb |
5'→3'外切酶活性:延伸至配对双链区时延伸受阻,此时新合成的互补链上形成“切刻”,5'→3'外切酶活性被激活:水解“切刻”5' 碱基,同时在“切刻”3' 合成新的碱基,此过程称为“切刻平移”。Taqman探针法Realtime PCR正是利用Taq 5'→3'外切酶活性水解探针,释放荧光信号。
3'→5'外切酶活性:PCR延伸过程嵌入错配碱基时延伸受阻,3'→5'外切酶活性被激活:切除错配碱基,继续延伸。但是3'→5'外切酶活性无法切除dUTP,并且pfu无法脱落,因此dUTP是pfu的不可逆抑制剂。dCTP会缓慢脱氨产生dUTP,反复冻融会加剧此过程,因此应尽可能小体积分装dNTP以减少反复冻融次数。
突变与保真性:随机突变:Taq无3'→5'外切酶活性,延伸过程嵌入错配碱基时大多数情况是延伸终止,但有一定的概率延伸可以继续,产生随机突变。pfu和Taq Plus具有3'→5'外切酶活性,能避免因嵌入错配碱基造成的随机突变。
C:G→T:A突变:DNA链中的胞嘧啶(C)会缓慢脱氨为尿嘧啶(U),从而产生C:G→T:A突变,高温会加剧此过程,使用pfu或者Taq Plus无法避免这种突变。因此,应尽可能使用较少的循环数,以减少DNA链中C→U转化比例,从而减少C:G→T:A突变。
PCR产物末端加A:延伸结束后,Taq在合成产物的3' 额外添加A形成粘末端,后者可以与T载体3' T配对。
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Taq DNA polymerase(2.5U/μl) 产品简介: Taq DNA polymerase具有5...
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pfu DNA polymerase(2.5U/μl) 产品简介: pfu DNA polymerase具...
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Taq plus DNA polymerase(2.5U/μl) 产品简介: Taq plus DNA...