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    DNA聚合酶

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    本公司提供的耐热DNA聚合酶彻底去除宿主基因组DNA和表达载体DNA,避免由于酶本身的DNA残留而导致的假阳性;优化Buffer体系,提高了PCR的灵敏度和特异性。

    下表为三种耐热DNA聚合酶的基本特性:    

    基本特性

    5'3'外切酶活性

    3'5'外切酶活性

    末端加A

    延伸速度

    有效扩增长度

    Taq DNA polymerase

    1-2 kb/min

    简单模5 kb,复杂模板3 kb

    pfu DNA polymerase

    0.5 kb/min

    简单模3 kb,复杂模板1 kb

    Taq plus DNA polymerase

    1 kb/min

    简单模15 kb,复杂模板10 kb

    5'3'外切酶活性:延伸至配对双链区时延伸受阻,此时新合成的互补链上形成“切刻”,5'3'外切酶活性被激活:水解“切刻”5' 碱基,同时在“切刻”3' 合成新的碱基,此过程称为“切刻平移”。Taqman探针法Realtime PCR正是利用Taq 5'3'外切酶活性水解探针,释放荧光信号。

    3'5'外切酶活性:PCR延伸过程嵌入错配碱基时延伸受阻3'5'外切酶活性被激活:切除错配碱基,继续延伸。但是3'5'外切酶活性无法切除dUTP,并且pfu无法脱落,因此dUTPpfu的不可逆抑制剂。dCTP会缓慢脱氨产生dUTP,反复冻融会加剧此过程,因此应尽可能小体积分装dNTP以减少反复冻融次数。

    突变与保真性:随机突变:Taq3'5'外切酶活性,延伸过程嵌入错配碱基时大多数情况是延伸终止,但有一定的概率延伸可以继续,产生随机突变。pfuTaq Plus具有3'5'外切酶活性,能避免因嵌入错配碱基造成的随机突变。

                          C:GT:A突变:DNA链中的胞嘧啶(C)会缓慢脱氨为尿嘧啶(U),从而产生C:GT:A突变,高温会加剧此过程,使用pfu或者Taq Plus无法避免这种突变。因此,应尽可能使用较少的循环数,以减少DNA链中CU转化比例,从而减少C:GT:A突变。

    PCR产物末端加A延伸结束后,Taq在合成产物的3' 额外添加A形成粘末端,后者可以与T载体3' T配对。